一、PFGE的基本原理

脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。

PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。

影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。

二、PFGE分类

(一)正交交变电场凝胶电泳

正交交变电场凝胶电泳(orthogonal fieldalternatinggelelectrophoresis，OFAGE)，两交变电场的电流方向相互垂直。

(二)反转电场凝胶电泳

反转电场凝胶电泳(field inversion gelelectrophoresis，FIGE)，交变电场均一并且是180’反向的。

三、PFGE的电泳条件

凝胶中琼脂糖的浓度一般为o．8％～1．5％，常用1％。电泳缓冲液为0．5XTBE，也可用TAE缓冲液。在OFAGE中对于20cm×20cm的凝胶，选择330V以上的电压，在0．5XTBE中的电流为100—200mA，以达到IOV／cm的电压。在FIGE中，一般选择140V的电压，0．5XTBE中的电流为50～60mA，电压一般为7V／cm。通常情况下，电泳宜在5～15℃的低温条件下进行；电泳缓冲液应在两极槽之间循环；而且低电压能产生较整齐的条带；交变电场的交叉角度越大分离效果越好。

电泳后DNA样品染色，采用0．5ug／mlEB浸泡30～45min，紫外灯下观察拍照。

四、PFGE技术的应用

(一)分离原核生物的染色体。

(二)人类染色体内切酶物理图谱分析，并将大片段DNA分子直接克隆，是人类基因组序列测定工程中有效的方法之一。

(三)探测细胞染色体上百万碱基对以上的基因组DNA的缺失。

(四)适于单向电场电泳难以分辨的DNA物理图谱的制作。