实时荧光定量简介

实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称“读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

定量检测是一种实时的PCR (qPCR)检测。测量（定量）每轮PCR扩增循环中，检测目标核酸片段的量。目标分子可以为DNA、cDNA或RNA。

实时PCR (qPCR) 定量检测工作原理

在PCR的起始循环中，荧光信号几乎不发生变化。从而定义为扩增曲线中的基线。而超出基线部分的荧光的增加，则为对累计目标分子的检测。固定的荧光阈值线，可设置在基线之上。荧光超过固定阈值时的循环数则为参数CT（阈值循环）。

绝对与相对定量

当对定量检测的结果进行计算时，可以采用绝对或相对定量。

绝对定量检测是根据标准曲线对未知样品进行的定量。

相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。

相对定量可根据从所有SDS仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：标准曲线法和比较CT法。

确定使用哪种方法所有方法都可产生同等的结果。当在确定使用哪种方法时，需要注意：

（1）在不同的反应管中进行目标分子和内源性对照的扩增时，采用标准曲线法进行分析，所需优化和验证操作最少。

（2）采用比较CT法时，则须进行验证实验，以表明目标分子和内源性对照扩增的效率基本相同。比较CT法的优势在于无需标准曲线，从而可以实现通量提高（因为无需额外的孔用于标准曲线的绘制）；并消除在进行标准曲线绘制时因稀释错误所带来的不利结果。

（3）如需将靶标和内源性对照品在同一管内进行扩增，则须优化并限制引物的浓度以避免对CT值产生影响。当在一管中进行双重反应时，可以提高通量并减少移液失误所带来的不利影响。

荧光探针和荧光染料

实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

实时荧光定量 PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外，我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前，实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：

1、DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

2、基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理和化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

3、基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。

随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。